arcticzymes尿嘧啶-DNA糖基化酶

Cod Uracil-DNA Glycosylase

鱈魚(yú)尿嘧啶-DNA糖基化酶

來(lái)自Atlantic Cod的Cod Uracil-DNA糖基化酶（Cod UNG）是僅有可商購(gòu)的UNG酶，其通過(guò)適度熱處理*且不可逆地滅活。該酶在含有修飾的Cod UNG基因的重組大腸桿菌（ung-）菌株中產(chǎn)生。

Cod UNG酶的主要優(yōu)點(diǎn)

• 熱不穩(wěn)定
• 在55°C時(shí)*不可逆地滅活
• 使用Cod UNG可在RT-PCR中實(shí)現(xiàn)污染控制
• PCR后不會(huì)降解PCR產(chǎn)物。這使得PCR產(chǎn)物的下游使用成為可能
• 高純度酶，無(wú)污染核酸酶測(cè)試

PCR攜帶預(yù)防

關(guān)于PCR預(yù)防的一般信息

PCR的高靈敏度，特別是qPCR，使得該方法易于污染，產(chǎn)生錯(cuò)誤或不準(zhǔn)確的結(jié)果。來(lái)自先前PCR的攜帶污染物被認(rèn)為是假陽(yáng)性結(jié)果的主要來(lái)源之一。由于氣溶膠，污染移液管，表面，手套和試劑，污染物可能從先前的擴(kuò)增反應(yīng)中帶走。

在擴(kuò)增DNA和RNA時(shí)，有兩種常見(jiàn)的策略可以防止污染物。一個(gè)是設(shè)置一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行設(shè)置和放大，大限度地減少移液步驟的數(shù)量，并防止擴(kuò)增后管子打開(kāi)。然而，由于實(shí)際原因，這并不總是可行的。此外，它無(wú)法保證避免污染。

防止污染的另一種常見(jiàn)的策略是在PCR擴(kuò)增期間用dUTP部分或*替代dTTP，從而產(chǎn)生含有尿嘧啶的DNA。在開(kāi)始PCR之前，用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UNG）處理PCR混合物。在初的變性步驟期間，溫度升高至95℃，導(dǎo)致脫嘧啶位點(diǎn)的裂解和攜帶DNA的片段化。由于模板含有胸苷，因此不受UNG處理的影響。所有PCR都是用dUTP替代dTTP進(jìn)行的先決條件。

使用我們的Cod UNG的好處是它在55?C時(shí)不可逆轉(zhuǎn)地滅活。Cod UNG是僅有兼容一步式RT-qPCR的UNG！

RT-qPCR中的PCR預(yù)防

Cod UNG是僅有兼容一步式RT-qPCR的UNG

在逆轉(zhuǎn)錄酶qPCR（RT-qPCR）中，RNA是初始模板。然而，污染物的問(wèn)題在這里可能與常規(guī)PCR一樣多。逆轉(zhuǎn)錄后，cDNA是PCR的模板。如果您的樣品被先前PCR的PCR產(chǎn)物污染，則引物無(wú)法區(qū)分cDNA和DNA，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。

在一步法RT-qPCR試劑盒中，將RNA加入含有逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的主混合物中，使cDNA合成和qPCR在同一試管中。 大腸桿菌 UNG / UDG的宜工作溫度可達(dá)約。50?C并且通常保持其活性達(dá)到約。70℃。該溫度范圍與一步法RT-qPCR方案中的殘留預(yù)防不相容，因?yàn)?nbsp; 大腸桿菌  UNG / UDG將在逆轉(zhuǎn)錄期間去除摻入cDNA中的尿嘧啶，從而導(dǎo)致模板降解。

來(lái)自ArcticZymes的重組表達(dá)的Cod UNG初是從冷適應(yīng)生物大西洋鱈魚(yú)中分離的。Cod UNG在20?C至40?C的溫度范圍內(nèi)具有高活性，在溫度高于42?C時(shí)會(huì)迅速失去活性，并且在55?C時(shí)已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)地失活。由于Cod UNG的宜溫度范圍與大腸桿菌相比要低得多  UNG / UDG，Cod UNG兼容單管RT-qPCR。通過(guò)添加Cod UNG至終濃度0.01U /μl簡(jiǎn)單地進(jìn)行殘留預(yù)防，并在開(kāi)始RT-qPCR之前在25℃引入5分鐘的孵育步驟?；蛘?，可以將濃度增加至0.04U /μl并省略預(yù)孵育步驟。Cod UNG將有效去除樣品設(shè)置和循環(huán)儀升溫過(guò)程中的殘留污染。

在這里，我們顯示Cod UNG可用于在含有dUTP而非dTTP的商業(yè)一步法RT-qPCR主混合物中進(jìn)行殘留物預(yù)防。用Cod UNG處理不影響靶cDNA，產(chǎn)生與未處理樣品相同的Cq值。為了比較，用通用UNG處理導(dǎo)致顯著的Cq延遲，證明與一步RT-qPCR不相容。

Cod UNG與一步式RT-qPCR兼容

圖1. Cod UNG與一步法RT-qPCR中的通用UNG相比較。進(jìn)行一步RT-qPCR，將Cod UNG和通用UNG與未處理的對(duì)照進(jìn)行比較。用Cod UNG處理不影響靶cDNA，產(chǎn)生與未處理樣品相同的Cq值。用通用UNG處理導(dǎo)致顯著的Cq延遲，證明與一步RT-qPCR不相容。

Cod UNG有效去除殘留的擴(kuò)增子

圖2. Cod UNG有效去除DNA。在進(jìn)行一步RT-qPCR之前，將含有尿嘧啶的DNA的加標(biāo)引入RNA樣品中。沒(méi)有引入預(yù)孵育步驟。用Cod UNG治療成功地將加標(biāo)的擴(kuò)增子移除至檢測(cè)限以下。

熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來(lái)源于嗜冷海洋細(xì)菌經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的的重組蛋白，又稱(chēng)南極熱敏UDG。該熱敏UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶，產(chǎn)生的缺嘧啶位點(diǎn)，在高溫或高 pH 下，極易水解斷裂。該酶對(duì)RNA無(wú)活性，主要用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來(lái)源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱，經(jīng)95℃10min處理仍會(huì)殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，導(dǎo)致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。而來(lái)源于嗜冷海洋細(xì)菌的熱敏UDG在50℃ 5min即*失活，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃10min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性）在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。