Product # LT-KDMB-A1 Ludger Document # LT-KDMB-A1-Guide-v6.3 

LudgerTagTM DMB 唾液酸放行和貼標(biāo)試劑盒產(chǎn)品指南

Ludger LT-KDMB-A1說明書

LT-KDMB-A1 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

LT-KDMB-A1

應(yīng)用 用于從糖蛋白中釋放唾液酸，并用 1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯標(biāo)記。2HCl (DMB)。

染料性質(zhì) 相對分子量 = 225.07 gmol-1

熒光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。

結(jié)構(gòu)

別名 DMB；1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯2鹽酸鹽；1,3-苯并二氧雜-5,6-二胺2鹽酸鹽；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧雜

性狀 該試劑盒包含用于從糖蛋白中釋放唾液酸的試劑。釋放的唾液酸通過胺化環(huán)化反應(yīng)與 DMB 染料結(jié)合。

樣本數(shù)量試劑盒包含多達(dá) 22 個(gè)樣本的試劑和材料，包括唾液酸參比組、N-乙酰神經(jīng)氨酸和 N-羥乙酰神經(jīng)氨酸定量標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品量 每次分析通常從 50-200µg 糖蛋白開始。我們建議一式三份分析樣本。

合適的樣本 糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的任何唾液酸均可被標(biāo)記。

儲(chǔ)存： Store at -18 ℃ 下避光儲(chǔ)存。避免熱源、光和濕氣。供應(yīng)的試劑可穩(wěn)定儲(chǔ)存至少兩年。

運(yùn)輸： 產(chǎn)品可在環(huán)境溫度下運(yùn)輸。

處理： 確保使用的任何玻璃、塑料器具或溶劑不含糖苷酶和環(huán)境碳水化合物。所有樣本處理程序均應(yīng)佩戴無粉手套，避免環(huán)境碳水化合物污染。

單個(gè)小瓶試劑開封后，應(yīng)立即使用其內(nèi)容物。根據(jù)當(dāng)?shù)匕踩?guī)則丟棄任何多余部分。

安全性： 僅供研究使用。不適用于人類或藥物

請閱讀所有所用化學(xué)品的安全數(shù)據(jù)表 (SDS)。涉及標(biāo)記試劑的所有過程均應(yīng)使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人安全防護(hù) – 眼鏡、耐化學(xué)腐蝕手套（如丁腈），并在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

套件內(nèi)容物

每個(gè)試劑盒包含以下各一瓶：

所需的其他試劑和設(shè)備

· 加熱塊、烘箱或類似的干式加熱器，設(shè)置為 80 ℃ 用于釋放唾液酸；設(shè)置為 50 ℃ 用于唾液酸標(biāo)記反應(yīng)

· 移液器范圍 1 至 1000µL 和吸頭

· 真空離心機(jī)

· 反應(yīng)瓶（例如 0.5 mL 聚丙烯瓶）

· 分析級水，例如。MilliQ

· 如果需要重復(fù)，則添加唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品 [可選]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01

· 附加唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品 Neu5,9Ac2 [可選]： CM-NEU5,9AC-01

· 工藝陽性對照品 [建議]：Ludger 胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U

Ludger Bioquant 糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U

貼標(biāo)時(shí)間線

LudgerTag™ 標(biāo)記程序，包括干燥時(shí)間和從

分析樣品，通常需要 7 小時(shí)加上干燥：

程序 時(shí)間

樣品制備 10 min + 干燥 (1-2 h) 可在前一天進(jìn)行

唾液酸的釋放 3 h

DMB 標(biāo)記 3.5 h

總時(shí)間： 干燥后 7 h

方法

1 樣品制備

· 我們建議在整個(gè)分析過程中取三份重復(fù)等份樣本。對于高唾液酸化糖蛋白，使用 50µg，對于具有低水平唾液酸化的 IgG 等樣品，使用高達(dá) 200µg。

• 請注意，一些常用于蛋白質(zhì)的鹽/緩沖液可能干擾唾液酸分析過程。這取決于與緩沖液體積相比的取樣量（因?yàn)榇罅烤彌_液會(huì)影響酸水解過程中溶液的酸度）。在我們的  當(dāng)樣品濃度高于 1 mg/mL 且采集 50-200µg 樣品進(jìn)行分析時(shí)，經(jīng)驗(yàn)緩沖液（如 PBS）不是問題。

· 我們建議您在整個(gè)過程中采用樣品進(jìn)行多項(xiàng)控制：陽性過程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U 陽性過程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U 陰性過程控制：水

陰性過程對照：樣品緩沖液

· 將樣品和過程控制等分（除非已經(jīng)干燥）至 0.5 mL 聚丙烯小瓶中，并在真空離心機(jī)中干燥。

2 唾液酸釋放

· 將烘箱設(shè)定為 80 °C

· 向樣品和過程控制小瓶中加入 25µL 2M 乙酸溶液。

不符合唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品：Neu5Ac (CM-NEUAC-01)、Neu5Gc (CM-NEUGC-01)、唾液酸參比組 (CM-SRP-01) 小瓶；或 Neu5,9Ac2 (CM-Neu5,9,Ac-01)（如使用）。

· 渦旋溶解，然后短暫離心。

· 將樣品和對照品置于設(shè)定為 80 ℃ 的烘箱中，孵育 2 小時(shí) (±5 min)。從烘箱中取出，冷卻至室溫。渦旋并短暫離心。

· 從每份樣品或過程對照品中取 5µL，轉(zhuǎn)移至 0.5 mL 聚丙烯瓶中，準(zhǔn)備用 DMB 標(biāo)記。

如果需要，酸釋放樣品可在-20 ℃ 下儲(chǔ)存至少 2 天 [Ref1]。

3 DMB 標(biāo)簽

· 將烘箱溫度設(shè)定為 50 ℃。

· 向連二亞硫酸鈉 LT-DITHIO-01 小瓶中加入 440µL 巰基乙醇溶液 LT-MERCAPTO-01，并通過移液器吹打混勻，直至固體*溶解。

· 將該溶液全部加入 DMB Dye LT-DMB-01 小瓶中，并通過移液器吹打混勻，直至染料溶解。

將標(biāo)記試劑暴露于潮濕和光照條件下，并在 60 min 內(nèi)使用。

· 向各樣品和工藝對照品中加入 20µL 標(biāo)記試劑，蓋上管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標(biāo)記溶液位于小瓶底部。

• 向各唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸參比組，如需要，加 Neu5,9Ac2）中加入 20µL 標(biāo)記試劑，蓋上管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標(biāo)記溶液位于小瓶底部。

將樣品、對照品和標(biāo)準(zhǔn)品置于設(shè)定為 50 ℃ 的烘箱中，并在  暗處。

在孵育期間，您可以開始調(diào)節(jié)準(zhǔn)備用于分析的 LC– 見第 4 節(jié)。

· 從烘箱中取出小瓶，向各樣品和過程控制中加入 475µL 水，終止反應(yīng)

向各唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品中加入 480µL 水

4 LC 分析

稀釋用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的 Neu5Ac 和 Neu5Gc 標(biāo)準(zhǔn)品（使用表 1 作為指導(dǎo)，因?yàn)?Neu5Gc 的含量通常低于 Neu5Ac，Neu5Gc 曲線的范圍比 Neu5Ac 低一個(gè)步驟）?；靹?。

這可以在“HPLC 條件色譜柱”運(yùn)行過程中完成。

表 1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋方案

· 用水（20µL 樣品加 180µL 水）以 1:10（比例 1:9）稀釋樣品。

· 用水以 1:10（比例 1:9）稀釋工藝對照品（和 Neu5,9Ac2，如使用）。

· 請勿稀釋唾液酸參比組 (SRP)。

注：如果已知樣品具有低水平的唾液酸化（例如 IgG）-則不得用水稀釋。如果發(fā)現(xiàn) LC 峰的面積不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，則制備濃度更高的樣品，或延長標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中于 10 ℃ 避光條件下可穩(wěn)定儲(chǔ)存至少 72 h [Ref2]。

· 準(zhǔn)備 LC 系統(tǒng)。確保預(yù)充溶劑管路。溶劑 A = 乙腈：甲醇：水 9:7:84

溶劑 B = 乙腈

熒光：激發(fā)波長：373 nm；發(fā)射波長：448 nm 柱溫 = 30 ℃；樣品溫度 = 10 ℃

表 2. 采用 LudgerSep-R1 色譜柱（4.6 x 150 mm，3µm 顆粒）LS-R1-4.6 x 150 進(jìn)行 HPLC 分析的 30 min 運(yùn)行方法。

進(jìn)樣體積 = 25µL。

表 3. 采用 LudgerSep-uR2 色譜柱 (2.1 x 100 mm，1.9) 進(jìn)行 UHPLC 分析的 15 min 運(yùn)行方法

µm 微粒）LS-UR2-2.1 x 100。

進(jìn)樣體積 = 5µL。

• 通過運(yùn)行適當(dāng)?shù)姆椒ǎū?2 使用 LudgerSep-R1 色譜柱進(jìn)行 HPLC 分析或表 3 使用 LudgerSep-uR2 色譜柱進(jìn)行 UHPLC 分析）調(diào)節(jié)色譜柱，不進(jìn)樣 2/3 次。然后注入水系統(tǒng)空白，并檢查基線是否穩(wěn)定。如果不是，則保持流動(dòng)注射直至基線穩(wěn)定，或在再調(diào)節(jié)前，用 10%a 和 90%B 沖洗 30 min。

• 下次運(yùn)行 2 次或更多次 SRP 唾液酸參比組進(jìn)樣，直至圖譜重疊。圖譜應(yīng)類似于圖 1 (HPLC) 或圖 2 (UHPLC)。然而，保留時(shí)間的變化取決于所使用的 LC 系統(tǒng)。

· LC 系統(tǒng)現(xiàn)在可以運(yùn)行樣品組了。我們建議按照以下順序（表 4）：

表 4. 進(jìn)樣順序

5 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

· 樣本集開始和結(jié)束時(shí) SRP 的曲線應(yīng)與小漂移重疊

例如：±0.1 min。

· Neu5Gc 和 Neu5Ac 的校準(zhǔn)曲線的 R2 值應(yīng) > 0.99。

• 根據(jù)內(nèi)部 SOP 分析的胎球蛋白的 Ludger 驗(yàn)收范圍為 252 至 377 nmol/mg 蛋白（其中，例如 34µg 胎球蛋白/50U）[Ref3]。當(dāng)我們收集更多 GCP-FET-50U 的內(nèi)部數(shù)據(jù)時(shí)，更新了該驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。在參考文獻(xiàn) 3 中列出了歷史驗(yàn)收范圍，并進(jìn)行了詳細(xì)解釋。

· 采用內(nèi)部 SOP 分析的 GPEP-A2G2S2 的 Ludger 驗(yàn)收范圍為 5.6-8.4 nmol。

（通過定量 NMR 測定的量±20%）

圖 1：在 LudgerSep-R1 HPLC 色譜柱上運(yùn)行的 DMB 標(biāo)記唾液酸參比組 (CM-SRP-01) 的色譜圖。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙酰基位置）；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時(shí)間取決于您實(shí)驗(yàn)室的 HPLC 系統(tǒng)設(shè)置。

圖 2：在 LudgerSep-uR2 UHPLC 色譜柱上運(yùn)行 DMB 標(biāo)記唾液酸參比組。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙?；恢茫? = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時(shí)間取決于您實(shí)驗(yàn)室的 UHPLC 系統(tǒng)設(shè)置。

參考文獻(xiàn)和相關(guān)文獻(xiàn)

1. Ludger 文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. DMB 標(biāo)記唾液酸冷凍影響的測定。

2. Ludger 文件：唾液酸分析用胎球蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-v2.0. 唾液酸分析中胎球蛋白系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的確定

3. Ludger 文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. 使用 Ludger 標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證 DMB 試劑盒。

4. Ludger 文件：“定量唾液酸分析”的應(yīng)用注釋 #APN002

反應(yīng)機(jī)制

標(biāo)記反應(yīng)為 2 步工藝。

1. 一步是將閉環(huán)（環(huán)狀）唾液酸平衡至開環(huán)（無環(huán)）形式。

• 
  第二步遵循多步驟機(jī)制，其中 DMB 染料的伯氨基與 α-酮酸的羰基反應(yīng)形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應(yīng)，從而與染料的另一伯胺反應(yīng)。重排得到熒光標(biāo)記的唾液酸（二亞胺）。

故障排除

1. HPLC 信號較低。

• 酸水解不*：我們建議使用烘箱而不是加熱塊進(jìn)行酸水解步驟。一些加熱塊導(dǎo)致樣品瓶蓋中的酸蒸發(fā)和冷凝，導(dǎo)致酸水解不*。我們還建議使用體積不超過 0.5 mL 的小樣品瓶進(jìn)行酸水解。

· 樣品中的鹽干擾標(biāo)記：鹽和緩沖液可干擾唾液酸

標(biāo)記方法。如果您懷疑鹽干擾您的樣本，則在分析前將樣本透析至無鹽溶劑中。

2. 色譜圖中游離染料峰的水平較高。

• 這可能是由于光暴露過多所致。確保孵育步驟在暗處進(jìn)行。標(biāo)記樣品后，好立即在 LC 上運(yùn)行，以避免降解，因?yàn)闃悠烽L時(shí)間暴露于光照和高溫會(huì)導(dǎo)致非唾液酸特異性色譜峰增加。隨著時(shí)間的推移，該問題也可能是由 LC 色譜柱污染引起的，見下文。

· 當(dāng) DMB 標(biāo)記樣本時(shí)，Neu5Ac 和 Neu5Gc 的量顯示穩(wěn)定

如果校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下儲(chǔ)存并同時(shí)進(jìn)行分析，則在 10 ℃ 下避光儲(chǔ)存長達(dá) 72 小時(shí) [參考文獻(xiàn) 3]。如果不可能，則 DMB 標(biāo)記的樣本可以冷凍長達(dá) 2 天 [參考 1]。

3. LC 色譜峰保留時(shí)間的變化；基線不穩(wěn)定。

• 錯(cuò)誤或舊 LC 溶劑。始終以相同方式制備溶劑（使溶劑達(dá)到  例如，通過將兩種溶劑混合在一起，在量筒中 1 升與單獨(dú)測量兩種溶劑并在瓶中混合是不相同的）。等度梯度對溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發(fā)，溶劑組成可能隨時(shí)間變化。

· 過量游離染料/肽等污染色譜柱可導(dǎo)致保留時(shí)間偏移

和色譜圖上的額外峰。對于唾液酸化水平較低的樣品（將大量蛋白進(jìn)樣至色譜柱中），這可能是更多的問題。用正常運(yùn)行溶劑和乙腈的 10:90 混合液以正常流速清洗色譜柱。

· (U) HPLC 系統(tǒng)的運(yùn)行條件尚未優(yōu)化。一個(gè)常見變量為

評估您是否正在使用 UHPLC，是“強(qiáng)/弱清洗”。這些可能對色譜產(chǎn)生顯著影響。作為一般規(guī)則，“弱清洗”使用弱梯度條件，“強(qiáng)清洗”使用強(qiáng)梯度條件。您需要評估哪些提供了與產(chǎn)品指南相匹配的 SRP 跟蹤。我們建議通過使用以下方法開始 LC 優(yōu)化  弱洗。

4. 問題：標(biāo)記液中有沉淀

• 盡管罕見，但在制備 DMB 標(biāo)記溶液（連二亞硫酸鈉、巰基乙醇和 DMB 染料的混合物）的過程中可能會(huì)形成輕微沉淀。我們還觀察到這種情況，檢測了該混合物的標(biāo)記效率，并證實(shí)沉淀物不影響標(biāo)記反應(yīng)。

5. 唾液酸參比組 (SRP) (U) HPLC 追蹤與指南中的追蹤不匹配

• 確保該參比標(biāo)準(zhǔn)品未進(jìn)行酸處理。酸處理后，SRP 軌跡將僅包含對應(yīng)于 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰。

保證和責(zé)任

Ludger 保證上述產(chǎn)品符合隨附的分析文件。如果產(chǎn)品因誤用以外的原因失效，Ludger 將根據(jù)其選擇免費(fèi)更換或退還購買價(jià)格。本保證為排他性保證，Ludger 不作任何其他明示或暗示保證，包括任何暗示條件或針對任何特定目的的適銷性或適用性保證。

Ludger 不對任何附帶、間接或或或有損害負(fù)責(zé)。本產(chǎn)品僅用于體外研究。

文件修訂編號

文件編號：LT-KDMB-A1-Guide-v6.3