一步法恒溫支原體檢測試劑盒(溶液型)說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

 哺乳動物細胞的培養(yǎng)，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數(shù)，導致實驗結(jié)果的不準確、甚至錯誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養(yǎng)都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

        培養(yǎng)法是相對可靠的支原體檢測技術(shù)，但是該方法非常耗時的，需要數(shù)周，不適合作為細胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養(yǎng)法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。

        有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，而且嚴重依賴實驗人員的經(jīng)驗，實驗的穩(wěn)定性極差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染。

        培養(yǎng)法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。

        本公司目前已經(jīng)開發(fā)出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各自都有自己的優(yōu)缺點。

        《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》使用恒溫基因擴增技術(shù)，有明顯的優(yōu)點：（1）整個檢測過程只需1小時，大大縮短了檢測時間；（2）未發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液中的PCR抑制劑會抑制恒溫基因擴增，所以一般無需進行樣品的前處理；（3）恒溫基因擴增的靈敏度良好，一般比30個循環(huán)普通PCR法高；（4）恒溫基因擴增的產(chǎn)物無需電泳，可以通過指示劑的顏色變化直接肉眼判斷反應結(jié)果；（5）無需用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀等儀器，整個檢測過程只需一個水浴鍋。

        經(jīng)測試，本試劑盒至少可以檢測以下13種支原體：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M. pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。其中，前8種為是最常見的污染細胞的支原體種類，約占污染細胞的支原體的98%左右。以上13種約占污染細胞的支原體種類的99%左右。

        《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》的檢測靈敏度：經(jīng)測試，在每個反應管的DNA加入量為2 μL的情況下，《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在20-400個copies，即10-200 copies/μL?？梢酝ㄟ^離心濃縮、提取支原體基因組DNA等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)提高10-100倍。

        由于任何一種快速支原體檢測方法都無法保證檢測結(jié)果100%正確，如果您想得到100%正確的支原體檢測結(jié)果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養(yǎng)的客戶，生產(chǎn)血清、胰酶、培養(yǎng)液的客戶，出售各種原代培養(yǎng)細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產(chǎn)的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結(jié)果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結(jié)果一致，正確率幾乎就是100%。

產(chǎn)品組分

（1）溶液1：1150 μL （50次檢測）；

（2）溶液2：55 μL；

（3）溶液3：指示劑，38 μL

（4）陽性支原體DNA：50 μL；     

（5）礦物油：1500 μL。

使用方法

使用方法

1. 待測樣品的準備：

     為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養(yǎng)液樣品需要取自換液后培養(yǎng)2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養(yǎng)液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yǎng)的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3天再取培養(yǎng)液進行檢測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理：

方法一：直接檢測（該方法無法去除可能的干擾物，顯色被干擾的可能性相對較大）：

（1）取150 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細胞沉淀）。

（2）已經(jīng)離心去除細胞的待測樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定），具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。 

方法二：簡單離心清洗（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高檢測的相對靈敏度，還可以去除絕大部分可能的干擾物，顯色被干擾的可能性極小。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除干擾物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。）：

（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi)，丟棄細胞沉淀。

（2）將上清繼續(xù)13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩(wěn)定，只適合當天或短期內(nèi)檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品而最后用20 μL重懸，則支原體濃度大約提高了75倍，相對靈敏度也提高了75倍】。

（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。

實驗案例分析

  我們選取了比較有代表性的4種支原體（分別是：M. hyorhinis，M. fermentans A. laidlawii和M. pirum），使用含相應支原體基因片段的質(zhì)粒載體，經(jīng)DNA定量后，計算出相應的分子數(shù)。

        質(zhì)粒經(jīng)4倍系列稀釋【從4^(0)到4^(-8)】，進行相應的恒溫擴增（每個反應管的DNA加入量為2μL，每個稀釋度做2個重復），并對恒溫擴增產(chǎn)物進行拍照。恒溫擴增反應的結(jié)果下圖所示：

注意事項

1. 請確保樣品加入后，反應之前：陰性、陽性和所有待測樣品的顏色基本一致。如果個別樣品，一旦加入，反應管的顏色就與陰性、陽性明顯不同，說明其中含有可干擾本系統(tǒng)正常指示效果的物質(zhì)，必須先去除。此現(xiàn)象曾經(jīng)在檢測CHO無血清培養(yǎng)基和一些血液制品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液等）上發(fā)生過。常見的DMEM、MEM、F12、1640等培養(yǎng)基（可以含10%血清）一般不會發(fā)生該現(xiàn)象。去除方法：（1）離心清洗：取1 mL細胞上清或待測樣品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液），先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩(wěn)定，只適合當天或短期內(nèi)檢測使用）重懸沉淀，吹吸均勻。該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。由于離心清洗可能導致支原體部分丟失，如果樣品支原體含量很低，可能導致漏檢。（2）使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》提取支原體DNA后進行檢測。通過DNA提取，即可以將所有可能的干擾物質(zhì)全部去除，又可以將支原體DNA濃縮10-100倍。

2. 由于恒溫擴增所用的各種酶強烈依賴溶液中的二價離子，待測樣品的EDTA等金屬離子螯合劑只能微量存在。如果打算用試劑盒提取支原體DNA（推薦使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》），請用去離子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的緩沖液洗脫和溶解DNA。

3. 防DNA污染注意事項：

（1）恒溫反應體系配制的房間（本試劑盒請在有窗戶、通風良好的普通房間操作。請勿在密閉的細胞培養(yǎng)間進行該步驟的操作，因為細胞培養(yǎng)間支原體污染概率很高），與用于樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間一定要分開。

（2）強烈建議使用濾芯吸頭吸取相關(guān)溶液和陽性支原體等。如果沒有濾芯吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。

（3）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。因此，最好使用全新購買的移液槍。如果沒有新購買的移液槍，至少應該使用以前沒有進行過細胞培養(yǎng)的移液槍。因為進行過細胞培養(yǎng)的移液槍極有可能被含支原體的培養(yǎng)液污染（如細胞培養(yǎng)時，不小心將含支原體污染的培養(yǎng)液吸入移液槍的槍體內(nèi)）。移液槍中吸附的支原體有可能造成不必要的假陽性。

（4）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務(wù)必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內(nèi)，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發(fā)，造成環(huán)境的污染，進而造成假陽性。

（5）整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。

（6）反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環(huán)境的污染。結(jié)果判斷完后，將其用自封袋密閉，扔到另外一個房間的垃圾桶內(nèi)。

4. 本試劑盒的檢測準確率：（1）由于本試劑盒能識別的支原體大概只占了污染細胞的支原體的99%左右，還有1%左右的污染細胞的支原體有可能不認識，這可能會導致1%左右的假陰性（漏檢）。（2）由于人體的口腔、皮膚和尿道都是含有支原體的，而且常用的腫瘤細胞系支原體污染率非常高，一般在15-90%之間，導致實驗室環(huán)境甚至移液槍也經(jīng)常含有支原體，這可能導致出現(xiàn)極個別的假陽性（多檢，正常這種概率應該低于1%）。總體來說，單獨使用本試劑盒有可能出現(xiàn)1-2%左右的錯誤率（注意：細胞培養(yǎng)中支原體出現(xiàn)的概率是來自文獻數(shù)據(jù)，是大量體外細胞培養(yǎng)支原體污染調(diào)查的結(jié)果。如果你們實驗室細胞污染的恰巧是出現(xiàn)概率比較低而本試劑盒又不認識的支原體，漏檢的概率會大幅度上升。因此：對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），不能只依靠本試劑盒就下最終檢測結(jié)論，必須至少同時使用另外一種支原體識別率為100%的支原體檢測試劑盒【比如本公司《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》】進行檢測，互相驗證?。榱颂岣邫z測的準確率，建議客戶采取以下兩種措施：第一，對所有本試劑盒檢測出的陽性樣品，利用本試劑盒或者其他不同原理的支原體檢測試劑盒進行復檢（復檢可以基本排除因環(huán)境污染導致的假陽性），或者檢測時所有樣品直接使用兩個反應管同時檢測檢測，只有同一個樣品兩個反應管的檢測結(jié)果都為陽性時，才能判斷為真正的陽性樣品。第二，對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），必須至少同時使用兩種（甚至三種）不同原理的支原體檢測試劑盒（其中一種方法推薦使用支原體識別率為100%的《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》）進行檢測，互相驗證。

5. 如發(fā)現(xiàn)細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環(huán)境專用殺菌劑。

6. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養(yǎng)數(shù)天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續(xù)提高10-100倍。該方法速度快，當天出結(jié)果，但是可靠性不如后面的培養(yǎng)法。（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。

7. 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液、生物制品、極個別細胞培養(yǎng)上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心后（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。

運輸及保存方法

        該產(chǎn)品隨冰袋運輸，收到產(chǎn)品后請立即放-20 ℃冰箱保存，該條件下，至少3年內(nèi)仍然有活性。

產(chǎn)品用途

   《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》（One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit）主要用于檢測細胞培養(yǎng)液或別的液體樣品中是否含有支原體。本產(chǎn)品僅供科研使用。